Nature：光学显微镜里程碑突破！

  细胞是生命的基本单位，包含许多维持和延续生命系统的复杂结构、过程和机制。许多细胞核心成分，如 DNA、RNA、蛋白质和脂质，大小只有几纳米。150 多年来，无论放大倍数如何，使用光学显微镜在图像中看到的细节都是有限的。这是因为光波在被限制后传播的方式——例如，通过镜头的光圈。因此，这些分子和结构的确切组成和排列通常是未知的，导致缺乏对生物学基本方面的机械理解。

  近年来，超分辨率技术取得了长足的进步，可以解析许多低于经典光衍射极限的亚细胞结构。当超分辨率显微镜问世时，它在生命科学领域产生了革命性的影响，以至于它的开发者获得了 2013 年的诺贝尔化学奖。单分子定位显微镜，或 SMLM，是一种超分辨率方法，能够最终靠暂时分离其各自的荧光发射来解析大小为 10 纳米的结构。由于单个目标在原本黑暗的视野中随机点亮（它们闪烁），因此能通过亚衍度确定它们的位置。由 Jungmann 小组发明的 DNA-PAINT 是一种 SMLM 技术，它使用染料标记的 DNA“成像器”链与其目标结合的互补物进行瞬时杂交，以实现超分辨率所需的闪烁。然而，迄今为止，即使是 DNA-PAINT 也无法解析最小的细胞结构。

  鉴于此，马克斯普朗克生物化学研究所 (MPIB) 和路德维希马克西米利安大学 (LMU) 的 Ralf Jungmann 研究小组在荧光显微镜方面取得了突破。该团队开发了序列成像 (RESI) 分辨率增强技术，这是一种革命性的技术，可将现成荧光显微镜的分辨率提高到 Ångström 级。通过以15nm的中等空间分辨率对稀疏目标子集进行顺序成像，研究人员证明了完整细胞中的生物分子能轻松实现单蛋白分辨率。此外，他们通过实验解决了Å分辨率的DNA折纸中单个碱基的DNA骨架距离。通过在原理验证演示中使用该方法，成功在未处理和药物处理的细胞中原位绘制免疫疗法靶标CD20的分子排列，这为评估靶向免疫疗法的分子机制提供了可能性。这些观察表明，通过在整个完整细胞中实现环境条件下的分子内成像，RESI缩小了超分辨率显微镜和结构生物学研究之间的差距，从而提供了理解复杂生物系统的关键信息。相关研究成果以题为“Ångström-resolution fluorescence microscopy”发表在最新一期《Nature》上。

  RESI技术利用DNA-PAINT通过独特的DNA序列编码目标身份的能力。通过用不同的DNA链标记相邻的靶标，它们彼此靠得太近，即使通过超分辨率显微镜也无法分辨，样品中会引入额外的分化程度（条形码）。通过顺序成像第一个，然后是另一个序列（并因此成为目标），现在可以明确地将它们分开。至关重要的是，由于它们是按顺序成像的，因此目标之间能随意靠近，这是其他技术没办法解决的问题。此外，RESI不需要专门的仪器，事实上，它能够正常的使用任何标准荧光显微镜进行应用，几乎所有研究人员都可以轻松使用它。

  为了证明RESI 在细胞环境中的适用性，作者接下来对核孔复合体 (NPC) 的结构蛋白进行了成像（图2）。他们实现了标签大小限制分辨率，使能够解析单个 Nup96 分子，解决了大多数 Nup96 蛋白对的这种空间排列。

  为了展示RESI在分辨率方面的飞跃，该团队为自己设定了解决生物系统中最小空间距离之一的挑战：沿着DNA双螺旋的各个碱基之间的分离，间隔小于1 nm。通过设计一种DNA折纸纳米结构，使其呈现出以一个碱基对距离从双螺旋突出的单链DNA序列，然后对这些单链进行顺序成像，研究小组解决了相邻碱基之间0.85 nm（或8.5 Å）的距离，这是以前很难来想象的壮举。研究人员以1 Å的精度完成了这些测量，凸显了RESI方法前所未有的能力。

  重要的是，该技术是通用的，并不局限于DNA纳米结构中的应用。为此，研究小组研究了利妥昔单抗的分子作用模式，利妥昔单抗是一种抗CD20单克隆抗体，于1997年首次获批用来医治CD20阳性血癌。然而，研究此类药物分子对分子受体模式的影响已经超出了传统显微镜技术的空间分辨率能力。了解这些模式是否以及如何在健康和疾病以及治疗时发生明显的变化，不仅对于基础机制研究很重要，而且对于设计新的靶向疾病疗法也很重要。

  通过使用RESI，Jungmann和他的团队能够揭示CD20受体在未处理细胞中作为二聚体的自然排列，并揭示CD20如何在药物医治后重新排列成二聚体链。对单蛋白水平的见解现在有助于阐明利妥昔单抗的分子作用模式。

  图 4. RESI 显示药物医治后亚纳米级精度的 CD20 受体（重组）组织

  这些实验表明，与使用其他令人印象非常深刻的荧光纳米技术创新相比，RESI在对分子的静态排列成像时提供了更高的分辨率。然而，该方法的局限性在于，RESI观察到的结构一定要保持静止足够长的时间才能收集到精确信息。对于一些生物实验，这在某种程度上预示着细胞必须是“固定的”，这会导致结构变形并防止动态过程跟着时间的推移被可视化。标签的大小也是一个限制因素，因为它是观察到的标签荧光部分的位置，而不是标签所连接的感兴趣的分子。虽然RESI不适用于运动分子的成像，但存在一些互补的方法。例如，另一种称为MINFLUX的定位技术接近RESI的成像细节能力，但也可以精确跟踪标记的单个分子的移动，只要它们与任何其他荧光分子至少有几百纳米。

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